INVESTIGACIÓN
E. COLI
Actividad antimicrobiana de los Constructive Microbes contra la bacteria Escherichia coli
Conclusión final
Los Constructive Microbes muestran una fuerte actividad bactericida contra Escherichia coli, manifestándose en una inactivación completa del 99,995 – 100% de las células bacterianas tras 24 horas de tratamiento y del 100% de las células tras 48 horas de tratamiento.
I. Información general
La prueba se llevó a cabo en el período del 7.11 al 21.11 de 2023, utilizando la cepa de referencia Escherichia coli ATCC25922 (fermentadora de lactosa). Para el recuento de células viables de E. coli, se empleó un medio selectivo y diferencial (agar MacConkey). Este medio contiene componentes que inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas (violeta cristal, sales biliares) y un componente diferencial (lactosa). Las cepas de E. coli fermentadoras de lactosa (lactosa-positivas) forman, tras 24 horas de incubación, colonias de color rojo a rosado, de 2–3 mm de diámetro (fig. 1).
Fig. 1. Crecimiento de colonias lactosa-positivas de Escherichia coli en agar MacConkey. Se inoculó en la placa una décima de mililitro de la suspensión salina de la cepa analizada.
II. Inoculación de Constructive Microbes en agar MacConkey
Dado que los Constructive Microbes consisten en una mezcla de células vivas de diversas especies bacterianas, en el primer paso del experimento el líquido (diluido 1:10 y 1:100) se aplicó sobre agar MacConkey. El medio se incubó en condiciones aeróbicas a 30 °C durante 48 horas. Tras 24 horas de incubación, se observó el crecimiento de colonias muy numerosas, pequeñas y lactosa-negativas (de menos de 0,5 mm de diámetro, fig. 2), así como de colonias moderadamente numerosas de 1,5–2 mm de diámetro (también lactosa-negativas). No se detectaron colonias lactosa-positivas en el medio. Por lo tanto, el agar MacConkey pudo utilizarse en las siguientes fases del experimento, y cualquier evidencia de colonias lactosa-positivas resultaría exclusivamente de la presencia de células vivas de Escherichia coli añadidas al líquido.
Fig. 2. Crecimiento de bacterias de Constructive Microbes en agar MacConkey (dilución 1:100, tiempo de incubación: 24 h). Solo se observan colonias pequeñas, lactosa-negativas (incoloras).
III. Preparación de la suspensión de E. coli
El cultivo de E. coli, crecido en agar soya-tripticaseína, se mezcló con solución salina para obtener una suspensión correspondiente a 0,5 del estándar de turbidez de McFarland. Posteriormente, con el fin de cuantificar el número de células, esta suspensión se diluyó 1:10.000 y 1:100.000, y se transfirieron 0,1 ml de cada dilución a una placa de Petri con agar soya-tripticaseína. Con base en el número de colonias desarrolladas, se calculó la concentración de células de E. coli en 5,4 × 10⁷/ml.
IV. Evaluación de la actividad de Constructive Microbes contra E. coli
La suspensión de E. coli preparada como se describió anteriormente (0,5 del estándar de McFarland) se mezcló con el líquido no diluido de Constructive Microbes en una proporción 1:1 (2 ml de suspensión de E. coli + 2 ml de líquido) y se dejó interactuar a temperatura ambiente. Después de 24 y 48 horas, así como a los 5 días de la prueba, se diluyeron 0,5 ml de la mezcla en 1:10, 1:100 y 1:10.000 con solución salina, y se inocularon 0,05–0,1 ml de cada dilución en agar MacConkey. Las placas se incubaron luego a 37 °C durante 24 horas. En cada tiempo evaluado, el número de células viables de E. coli se calculó en función del número de colonias lactosa-positivas desarrolladas en el medio. Para una mayor fiabilidad de los resultados, el procedimiento descrito en los puntos III y IV se realizó por duplicado.
En la primera serie del experimento, ya después de 24 horas de incubación de la suspensión de E. coli con Constructive Microbes, no se observó crecimiento alguno. Tampoco ocurrió crecimiento tras 48 horas ni después de 5 días de incubación. Por lo tanto, el líquido ensayado inactivó el 100% de las células de+ E. coli en tan solo 24 horas.
En el experimento repetido, después de 24 horas de incubación de la suspensión de E. coli con Constructive Microbes, no se detectó crecimiento de la bacteria en la dilución 1:10, pero sí se observó una colonia lactosa-positiva en la dilución 1:100 (fig. 3). Este hecho puede haberse debido bien a la transferencia accidental de una célula de E. coli durante la preparación de las diluciones seriadas, o bien a la inhibición por contacto del microorganismo por parte del líquido de Constructive Microbes más concentrado (es decir, 1:10) directamente en la superficie del medio.
Incluso si la presencia de una colonia de E. coli en la dilución 1:100 no fuese un accidente, el número de células viables del microorganismo después de 24 horas de tratamiento con Constructive Microbes sería de 2 × 10³, lo que equivale a una reducción del 99,995% respecto al número inicial de células.
Fig. 3. Agar MacConkey inoculado con suspensión de E. coli,
previamente incubada con Constructive Microbes durante 24 horas. Izquierda: dilución 1:100; derecha: dilución 1:10. Se observan numerosas colonias pequeñas lactosa-negativas en la dilución 1:10 y una colonia lactosa-positiva (típica de E. coli) en la dilución 1:100.